Development and characterization of doxorubicin nanocarriers based on stabilized with the silicone layer lipid vesicles.

Celem niniejszej pracy licencjackiej była synteza nanonośników w postaci liposomów kationowych, ich stabilizacja poprzez utworzenie sieci silikonowej wewnątrz dwuwarstwy liposomowej przy użyciu prekursora 1,3,5,7-tetrametylocyklotetrasiloksanu (D4H), enkapsulacja do ich wodnego rdzenia doksorubicyny (DOX) oraz scharakteryzowanie utworzonych układów. Wprowadzony do układu D4H nie powodował dezintegracji pęcherzyków lipidowych, a dodatkowo pozwalał utrzymać stałe wartości średnich średnic hydrodynamicznych oraz potencjału zeta przez dłuższy niż w przypadku liposomów kationowych czas, co potwierdzają analizy wykonane przez Zetasizer Nano. Eksperyment miareczkowania spektrofotometrycznego za pomocą Tritonu X-100 pokazał, że stabilizowane nanonśniki wykazują nieco większą stabilność niż liposomy bez otoczki. Wygaszanie fluorescencji potwierdziło enkapsulację doksorubicyny wewnątrz pęcherzyków lipidowych. Wreszcie, pomiary średnic hydrodynamicznych i potencjału zeta przeprowadzone w kilku punktach czasowych udowodniły, że stabilizowane nanonośniki mają znacznie mniejszą tendencję do agregacji niż same liposomy kationowe. Na podstawie przeprowadzonych badań fizykochemicznych można wnioskować, że opracowane układy stabilizowane warstwą silikonową wydają się być obiecującymi nanonośnikami dla doksorubicyny. Aby jednak udowodnić tę koncepcję, konieczne jest przeprowadzenie szeroko zakrojonych badań biologicznych.The aim of this thesis was synthesis of nanocarriers in the form of cationic liposomes, their stabilization by formation of silicone network inside the liposomal bilayers using precursor 1,3,5,7-tetramethylcyclotetrasiloxane (D4H), encapsulation to their aqueous core doxorubicin (DOX) and characterization of the created systems. It was confirmed by Zetasizer Nano analyses that D4H introduced into the system did not cause disintegration of the lipid vesicles structure , and additionally enabled to maintain constant values of hydrodynamic diameters and zeta potential longer than in the case of pristine cationic liposomes. The experiment of spectrophotometric titration with Triton X-100 showed that silicone stabilized nanocarriers exhibit slightly better stability than pure liposomes. Fluorescence quenching confirmed successful encapsulation of doxorubicine inside the aqueous core of lipid vesicles. Finally, measurements of hydrodynamic diameters and zeta potential carried out at several time points showed the silicone stabilized nanocarriers have considerably lower tendency for aggregation than the pristine liposomes. Based on the performed physicochemical studies it might be concluded that developed silicone-stabilized systems seem to be promising nanocarriers for doxorubicin. However, to prove that concept the extensive biological studies are necessary

Development of biomimetic, multifunctional hybrid hydrogel materials for applications in tissue engineering

Celem ninejszej pracy magisterskiej było opracowanie i scharakteryzowanie wielofunkcyjnego hybrydowego materiału hydrożelowego w zastosowaniu do regeneracji niewielkich ubytków tkanki kostnej.Podstawowy element otrzymanych układów stanowi hydrożelowa, sieciowana genipiną matryca na bazie trzech biopolimerów: kolagenu (Col), zmodyfikowanego lizyną kwasu hialuronowego (HAmod) oraz chitozanu (Ch), do której wprowadzono bioaktywny nośnik w postaci sfunkcjonalizowanych grupami aminowymi krzemionkowych cząstek z przyłączoną insuliną (INS) - substancją aktywną wspomagającą procesy kościotworzenia. Z uwagi na doniesienia literaturowe dotyczące częściowej biologicznej dezaktywacji białek w wyniku trwałego ich przyłączenia do nośników przetestowano dwa alternatywne podejścia bazujące na różnych oddziaływaniach pomiędzy cząstkami krzemionkowymi a insuliną, w tym przyłączenie kowalencyjne i elektrostatyczne.Morfologię i rozmiary uzyskanych cząstek określono w oparciu o badania z wykorzystaniem techniki SEM. Eksperyment immobilizacji białka zoptymalizowano w oparciu o oznaczenie za pomocą testu ninhydrynowego dostępnych na powierzchni cząstek krzemionkowych grup aminowych.. Potwierdzenie efektywności przyłączenia INS wykazano techniką FTIR, a jej zawartość określono na podstawie oznaczenia Bradforda. Rozmieszczenie biomolekuł w układach cząstki krzemionkowe- insulina oraz charakter wiązań w nich występujących zweryfikwano za pomocą spektroskopii fotoelektronów w zakresie promieniowania X (XPS). W kolejnym etapie pracy otrzymano serię materiałów hybrydowych o stałym składzie matrycy polimerowej (stosunek wagowy Col:Ch:HAmod = 50/20/30) dwóch rodzajach cząstek odpowiednio SiO2-NH2-INS(elektro.) i SiO2-NH2-INS(kowal.), stosując przy tym trzy stężenia insuliny (C1=7,2μM, C2=36μM, C3=180μM). Materiały hybrydowe poddano badaniom biomineralizacji in vitro w środowisku symulującym ludzkie osocze, które dowiodły ich bioaktywności już po 5 dniach inkubacji (badania SEM i EDS) Wykonane w warunkach in situ testy reologiczne potwierdziły zachowanie wstrzykiwalności opracowanych systemów hybrydowych a także dostarczyły informacji na temat ich właściwości mechanicznych oraz czasu żelowania.. Otrzymana charakterystyka wytworzonych układów sugeruje, iż stanowią one obiecującą alternatywę dla konwencjonalnych sposobów wspomagania regeneracji tkanki kostnej, zwłaszcza w przypadku niewielkich ubytków. Utworzone materiały wydają się być szczególnie interesujące głównie ze względu na ich wygodną, małoinwazyjną i precyzyjną metodę wprowadzania w formie zastrzyku przy jednoczesnym zachowaniu zdolności do indukowania procesów biomineralizacji. Badania biologiczne in vitro mające na celu zweryfikowanie biologicznej aktywności INS w otrzymanym układzie hybrydowym są obecnie w trakcie realizacji.The aim of this Master's thesis was the fabrication and characterization of the biomimetic, multifunctional hybrid hydrogel material for application in regeneration of small bone tissue defects. The major constituent of the obtained systems is a hydrogel, crosslinked with genipin matrix based on three biopolymers: collagen (Col) lysine modified hyaluronic acid (HAmod) and chitosan (Ch) into which a bioactive carrier in the form of amine functionalized silica particles with insulin attached (INS) - an active substance supporting bone formation processes was introduced. Considering the literature reports on the partial biological deactivation of proteins as a result of their permanent attachment to carriers, two alternative approaches based on different interactions between silica particles and insulin, including covalent and electrostatic attachment, were tested.The morphology and size of the resulting particles were determined by means of SEM technique. The protein immobilization experiment was optimized based on the determination of the amino groups available on the surface of silica particles employing the ninhydrin test. Confirmation of the efficiency of INS attachment was demonstrated by the FTIR technique while its content was evaluated by the Bradford assay. The biomolecules distribution in the silica particles-insulin systems and the character of formed bonds were determined utilizing the photoelectron spectroscopy in the X-ray range (XPS). In the next stage of work the series of hybrid materials with the selected composition of polymeric matrix (the weight ratio of Col:Ch:HAmod was 50/20/30), two types of particles (SiO2-NH2-INSelektro and SiO2-NH2-INSkowal, respectively) and applying three insulin concentration (C1=7.2μM, C2=36μM, C3=180μM) were fabricated. The hybrid materials were subjected to in vitro biomineralization tests under simulating human plasma conditions and their bioactivity after 5 days of incubation was revealed (SEM and EDS studies). Rheological tests performed in situ confirmed the injectability of the developed hybrid systems and provided information on their mechanical properties and gelating time. The obtained characteristics of the manufactured systems suggest that they could be a promising alternative to conventional approaches of supporting bone regeneration, especially in the case of small defects. The created materials seem to be of particular interest mainly due to their convenient, minimally invasive and precise injection method while maintaining the ability to induce biomineralization process. In order to verify the biological activity of INS in the obtained hybrid system in vitro biological research are currently performed in our laboratories

Strategies increasing the effectiveness of temozolomide at various levels of anti-GBL therapy

Glioblastoma (GBL) is the most common (60–70% of primary brain tumours) and the most malignant of the glial tumours. Although current therapies remain palliative, they have been proven to prolong overall survival. Within an optimal treatment regimen (incl. surgical resection, radiation therapy, and chemotherapy) temozolomide as the current anti-GBL first-line chemotherapeutic has increased the median overall survival to 14–15 months, and the percentage of patients alive at two years has been reported to rise from 10.4% to 26.5%. Though, the effectiveness of temozolomide chemotherapy is limited by the serious systemic, dose-related side effects. Therefore, the ponderation regarding novel treatment methods along with innovative formulations is crucial to emerging the therapeutic potential of the widely used drug simultaneously reducing the drawbacks of its use. Herein the complex temozolomide application restrictions present at different levels of therapy as well as, the currently proposed strategies aimed at reducing those limitations are demonstrated. Approaches increasing the efficacy of anti-GBL treatment are addressed. Our paper is focused on the most recent developments in the field of nano/biomaterials-based systems for temozolomide delivery and their functionalization towards more effective blood-brain-barrier crossing and/or tumour targeting. Appropriate designing accounting for the physical and chemical features of formulations along with distinct routes of administration is also discussed. In addition, considering the multiple resistance mechanisms, the molecular heterogeneity and the evolution of tumour the purposely selected delivery methods, the combined therapeutic approaches and specifically focused on GBL cells therapies are reviewed